埃德曼降解法
Edman降解(埃德曼降解,英語:Edman degradation),也根据所使用试剂而被称为“PTC法”或“PTH法”,是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔·埃德曼(Pehr Edman)首先创立。[1]
机理
编辑用异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate, 缩写:PITC)与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应,生成苯硫脲(PTC)的衍生物,於酸性條件之下生成五元环,肽链N-端被选择性地切断,得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来,酸作用下,该衍生物不稳定,会继续反应,形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲(PTH)衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲(PTH-氨基酸),可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次,结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽,剩下的肽链可以进入下一个循环,继续发生降解。
在1967年就出现了实现根据此原理设计的自动化仪器。[2]利用自动分析仪进行分析时,能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列,最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下,每形成一次PTH-氨基酸,效率可保持在99%以上。而且此法用量少,一般只用10-100皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。对于肽链较长的多肽,可以先将肽链切断成多个小肽,对这些小肽进行氨基酸分析,然后将这些信息拼接起来,得到起始肽链中的氨基酸序列。
限制
编辑由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的,因此当N-端被其他化学基团所封闭时,就需要先去除这些基团,然后才能进行测序。此外,蛋白质中含有半胱氨酸残基时,有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下,需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H,然后才能用Edman降解测定序列。
另外,由於所有反應都在封閉或體外的環境之下,勢必會達到平衡,因此若在第一個試管裡加入PITC,它會和試管內的第一個氨基酸的N-端氨基結合,可是由於平衡原理:PITC 一段氨基酸序列 = PITC-氨基酸 少了第一個氨基酸的氨基酸序列,因此在第一個試管裡會同時存在沒有結合PITC和有結合PITC的氨基酸序列,這會導致我們將第一管有PITC-氨基酸的物質分離後,繼續在第二個試管裡加入PITC,則此時第二個試管裡會含有少量的PITC-氨基酸(1)和多量的PITC-氨基酸(2)。這時候我們可以利用联用质谱法(Tandem mass spectrometry (页面存档备份,存于互联网档案馆))等技術來分析,若分析後發現量多者為PITC-氨基酸(2),量少者則為PITC-氨基酸(1),因此我們就解決了反應不完全的問題。而另外一個問題也隨之衍生,一旦我們不停地重複此步驟,得到氨基酸的序列時,一直到約第50個試管開始,就會發現所以氨基酸的量經分析後都會變得幾乎一樣,這樣我們就沒有辦法可以知道氨基酸的序列。這也就是為什麼我們需要先將一段大於50個氨基酸的序列用水解酶給進行切割,讓所有片段的氨基酸序列小於50,這樣我們才可以得到比較準確的氨基酸序列。
参见
编辑参考资料
编辑- ^ Edman, Pehr; Högfeldt, Erik; Sillén, Lars Gunnar; Kinell, Per-Olof. Method for Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides.. Acta Chemica Scandinavica. 1950, 4: 283–293. ISSN 0904-213X. doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283.
- ^ Edman, P.; Begg, G. A Protein Sequenator. European Journal of Biochemistry. 1967, 1 (1): 80–91. ISSN 0014-2956. doi:10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x.