اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومتر چیست؟

دو مدل از اسپکتروفتومترهای UV-Vis

اسپکتروفتومتری UV-Vis یک تکنیک تحلیلی قدرتمند است که در زمینه‌های علمی مختلف برای اندازه‌گیری جذب نور در محدوده‌های فرابنفش (UV) و مرئی (Vis) طیف الکترومغناطیسی استفاده می‌شود. طیف‌سنجی مرئی فرابنفش (UV-Vis) روشی آنالیزی است که به طور گسترده در بسیاری از زمینه‌های علم از کشت باکتری، شناسایی دارو و بررسی خلوص اسید نوکلئیک گرفته تا کنترل کیفیت در صنعت نوشیدنی و تحقیقات شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرد.

اسپکتروفتومتر UV-Vis با اندازه گیری شدت نور عبوری از محلول نمونه و مقایسه آن با شدت نور اولیه یا عبوری از حلال، اطلاعات ارزشمندی در مورد خواص مواد و برهمکنش آنها با نور ارائه می کند. همچنین با استفاده از این دستگاه می‌توان بعضی از مواد را شناسایی کرد و غلظت آن ها را با اندازه گیری شدت نور عبوری یا جذب شده به دست آورد.

نور دارای مقدار معینی انرژی است که با طول موج آن نسبت معکوس دارد. بنابراین، طول موج‌های کوتاه‌تر نور، انرژی بیشتری و طول‌موج‌های بلندتر، انرژی کمتری دارند. مقدار خاصی از انرژی برای ارتقای الکترون‌های یک ماده به حالت انرژی بالاتر مورد نیاز است که می‌توانیم آن را به عنوان جذب ماده معرفی کنیم. الکترون‌ها در محیط‌های پیوندی مختلف در یک ماده به مقدار خاصی از انرژی برای ارتقای الکترون‌ها به حالت انرژی بالاتر نیاز دارند. به همین دلیل است که جذب نور برای طول موج های مختلف در مواد مختلف اتفاق می افتد. انسان ها قادرند طیفی از نور مرئی را از حدود 380 نانومتر که ما به صورت بنفش می بینیم تا 780 نانومتر که آن را قرمز می بینیم، مشاهده کنند. بنابراین، نور را می توان با طول موج آن توصیف کرد، که می تواند در طیف سنجی UV-Vis برای تجزیه و تحلیل یا شناسایی مواد مختلف مفید باشد.

طرز کار اسپکتروفتومتر

اجزای اصلی یک اسپکتروفتومتر

هنگامی که نور فرودی به یک جسم برخورد می کند، می تواند جذب، منعکس یا عبور پیدا کند. اسپکتروفتومتر شدت نور جذب شده یا عبور یافته از ماده در محدوده UV و Vis را اندازه گیری می کند. با اعمال قانون Beer-Lambert که بیان می کند مقدار نور جذب شده با غلظت نمونه و طول مسیر نسبت مستقیم دارد، اسپکتروفتومتر می تواند غلظت آنالیت های خاص را در نمونه تعیین کند.

در حالی که انواع گوناگونی از اسپکتروفتومترهای UV-Vis وجود دارد، برای درک بهتر نحوه عملکرد آن ها، اجزای اصلی این دستگاه ها را بررسی می کنیم.

منبع نور

اسپکتروفتومترها دستگاهی مبتنی بر نور هستند از این رو حضور یک منبع پایدار که می تواند نور را در طیف گسترده ای از طول موج ها نشر دهد ضروری به نظر می رسد. معمولاً در این دستگاه ها یک لامپ زنون به عنوان منبع نور با شدت بالا برای هر دو محدوده UV و مرئی استفاده می شود. با این حال، لامپ های زنون هزینه زیادی دارند و در مقایسه با لامپ های تنگستن و هالوژن نیز از پایداری کمتری برخوردار هستند. برای دستگاه هایی که از دو لامپ مجزا استفاده می کنند، معمولاً یک لامپ تنگستن یا هالوژن برای نور مرئی و یک لامپ دوتریوم به عنوان منبع نور UV به کار گرفته می شود. در این نوع از اسپکتروفتومترها منبع نور تابیده شده به سطح ماده در حین اندازه گیری تغییر می کند. این جابجایی معمولاً در طول موج 300 تا 350 نانومتر اتفاق می‌افتد، جایی که انتشار نور از هر دو منبع نور مشابه است و می‌توان این انتقال را راحت‌تر صورت داد.

انتخاب طول موج

در مرحله بعد، طول موج های مشخصی از نور منتشر شده توسط منبع، که در طول موج های گسترده ای ساطع شده، انتخاب می شوند. این گزینش متناسب با نوع نمونه و آنالیت و نحوه شناسایی مشخصات آن ها صورت می گیرد. مرسوم ترین روش های موجود برای این کار عبارتند از:

مونوکروماتورها: یک مونوکروماتور (تک رنگ کننده) نور را به یک نوار باریک از طول موج ها جدا می کند. اساس این دستگاه ها، توری های پراش قابل چرخش است که با دوران آن ها زاویه ورودی و بازتابی نور و در نتیجه طول موج مورد نظر از آن تعیین می شود. هر چه این توری دارای تعداد شیار بیشتری باشد وضوح بهتری را ارائه می دهد اما محدوده طول موجی قابل استفاده آن کمتر می شود. به عکس هرچه توری پراش تعداد شیار کمتری داشته باشد وضوح طیفی آن کاهش و بازه طول موجی آن افزایش پیدا می کند. توری های با تعداد شیار 300 تا 2000 در میلی متر برای دستگاه های طیف سنجی UV-Vis قابل استفاده است اما معمولاً توری های با 1200 شیار در میلی متر در این دستگاه ها به کار گرفته می شوند. کیفیت اندازه‌گیری‌های طیف‌سنجی در این دستگاه ها به عملکرد توری پراش و چیدمان نوری آن ها وابسته است.

فیلترهای جذبی: فیلترهای جذبی که معمولاً از شیشه یا پلاستیک رنگی ساخته می شوند برای جذب طول موج خاصی از نور به کار گرفته می شوند.

فیلترهای تداخلی: همچنین فیلترهای دو رنگ (دیکروییک) نیز نامیده می شوند، این فیلترهای رایج از لایه های زیادی از مواد دی الکتریک ساخته شده اند که در آن تداخل بین لایه های نازک مواد رخ می دهد. این فیلترها را می توان برای حذف طول موج های نامطلوب با تداخل مخرب استفاده کرد، بنابراین به عنوان انتخاب کننده طول موج عمل می کنند.

فیلترهای قطع (Cutoff): فیلترهای قطع اجازه عبور نورهای با طول موج کمتر (کوتاه گذر) یا بیشتر (بلند گذر) از یک طول موج مشخص را می دهند. این محدود سازی معمولاً با استفاده از فیلترهای تداخلی اجرا می شود.

فیلترهای باند گذر(Bandpass): فیلترهای باند گذر به طیف وسیعی از طول موج ها اجازه عبور می دهند که می توان آن ها را با ترکیب فیلترهای کوتاه گذر و طولانی گذر ایجاد کرد.

در مجموع باید گفت که اسپکتروفتومترهای امروزی از مونوکروماتورها بهره می برند؛ چرا که ویژگی ها و قابلیت های بهتری را در اختیار قرار می دهند. البته انواع مختلفی از فیلترها نیز در کنار مونوکروماتورها به کار گرفته می شوند تا طول موج‌های نور انتخاب‌شده دقت بیشتری داشته باشند و میزان نسبت سیگنال به نویز نیز بهبود پیدا کند.

تجزیه و تحلیل نمونه

در اسپکتروفتومتر هر طول موج انتخاب شده از نور مرجع از درون نمونه عبور داده می شود تا میزان جذب یا عبور نور توسط آن اندازه گیری شود. همه این اندازه گیری ها به نسبت میزان جذب یا عبور نور توسط نمونه مرجع، که اغلب به آن «نمونه خالی یا Blank» می‌گویند، محاسبه می شود. نمونه مرجع معمولاً یک کووت پر شده با حلال مشابهی است که برای تهیه نمونه اصلی از آن استفاده شده است. به عنوان مثال هنگام بررسی کشت های باکتریایی، محیط کشت استریل به عنوان نمونه مرجع استفاده می شود.

آگاهی از مواد و شرایط مورد استفاده در آزمایش‌های طیف‌سنجی UV-Vis بسیار مهم است. به عنوان مثال، اکثر کووت های پلاستیکی برای مطالعات جذب UV نامناسب هستند، زیرا پلاستیک عموماً نور UV را جذب می کند. معمولاً از نگهدارنده نمونه کوارتز برای بررسی میزان جذب یا عبور نور UV استفاده می شود؛ زیرا کوارتز در برابر اکثر نور ناحیه UV شفاف است. هوا همچنین ممکن است به عنوان یک فیلتر در نظر گرفته شود زیرا طول موج های نور کوتاهتر از حدود 200 نانومتر توسط اکسیژن مولکولی موجود در هوا جذب می شوند. برای اندازه‌گیری‌هایی با طول‌موج‌های کوتاه‌تر از 200 نانومتر به یک چیدمان خاص و گران‌تر نیاز است. اسپکتروفتومترهای بدون کووت نیز در بازار موجود هستند که امکان تجزیه و تحلیل نمونه های با حجم بسیار کوچک را فراهم می‌کنند. این دستگاه ها در تجزیه و تحلیل DNA یا RNA مورد استفاده قرار می گیرند.

تشخیص

پس از عبور نور از نمونه، یک آشکارساز برای تبدیل نور به سیگنال الکترونیکی قابل خواندن مورد استفاده قرار می گیرد. به طور کلی، اساس کار آشکارسازها بر اساس پوشش های فوتوالکتریک یا نیمه هادی ها هستند.

یک پوشش فوتوالکتریک وقتی در معرض نور قرار می گیرد، الکترون های دارای بار منفی ایجاد می کند. هنگامی که الکترون ها پرتاب می شوند، جریان الکتریکی متناسب با شدت نور دریافتی ایجاد می شود. Photomultiplier Tube که به اختصار PMT خوانده می شود یکی از آشکارسازهای رایج مورد استفاده در دستگاه های طیف‌سنجی UV-Vis است. اساس کار PMT ها مبتنی بر اثر فوتوالکتریک است. آن ها پس از اینکه در معرض نور قرار گرفتند جریانی از الکترون‌ها را ایجاد می کنند. سپس این الکترون ها با مکانیزمی به صورت ترتیبی ضرب می شوند تا یک جریان الکتریکی بزرگتر تولید شود. آشکارسازهای PMT به طور ویژه در تشخیص نورهای ضعیف عملکرد بسیار خوبی دارند.

هنگامی که نیمه هادی ها در معرض نور قرار می گیرند، جریان الکتریکی متناسب با شدت نور می تواند از آن ها عبور کند. دیودهای نوری و CCDها دو نوع رایج از آشکارسازهای مبتنی بر فناوری نیمه هادی هستند.

پس از اینکه جریان الکتریکی از آشکارسازهای مورد استفاده تولید شد، سیگنال شناسایی شده به کامپیوتر یا صفحه نمایش منتقل می شود تا نمایش آن صورت بگیرد.

تفاوت اسپکتروفتومتر و اسپکترومتر

تفاوت اسپکترومتر و اسپکتروفتومتر

اسپکترومتر صرفا نوری را که از شکاف وارد دستگاه می‌شود، تجزیه و تحلیل می‌کند. البته ذکر این نکته حائز اهمیت است که با استفاده از طیف‌سنج می‌توان میزان نور جذبی، عبوری، بازتابی و فلورسانس را به دست آورد. برای این کار، باید چیدمان اپتیکی آزمایش مورد نظر روی میز آماده گردد (البته تجهیزاتی مانند منبع نور، فیبر و … مورد نیاز  است). اسپکترومتر برای تجزیه و تحلیل منابع نوری نیز به کار می‌رود.

اسپکتروفتومتر ترکیبی از منابع نوری و اسپکترومتر است. برای محاسبه میزان جذبی و عبوری نیازی به چیدمان اپتیکی نیست و همه المان‌ها در داخل دستگاه جای گرفته‌اند.

جستارهای وابسته

• اسپکتروفتومتری
• اسپکترومتر